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RNAfixer 無液氮 RNA 樣品儲存液

簡要描述:

RNAfixer 無液氮 RNA 樣品儲存液公司正在出售的產品:鴨胚肝間質細胞(永生化) G蛋白偶聯嘌呤受體p2y12封閉多肽 滅鮭氣單胞菌PCR檢測試劑盒 大鼠膠原酶I(Collagenase I)ELISA檢測試劑盒 6磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6PGDH)酶活性比色法檢測試劑盒 ?,F青霉 卷曲螺旋結構域蛋白25抗體

更新時間:2024-01-12

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RNAfixer 無液氮 RNA 樣品儲存液

商品屬性:

產品名稱

規格

貨號

RNAfixer 無液氮 RNA 樣品儲存液

100ml

A-Hc2011


保存條件:

室溫(18-25℃)保存1 年以上,如果使用時發現有沉淀或者析出,可以37℃水浴加熱重新溶解后使用,重新溶解后不會影響產品質量。
產品介紹:
RNAfixer 是一種液態的無毒的組織保存液體,可以迅速滲入新鮮組織細胞的胞漿中,在非凍狀態下原位穩定和保護細胞內的RNA。取下組織薄片后立刻浸入RNAfixer 保存并不影響將來提取RNA 的質量和數量。RNAfixer 消除了RNA 樣品需要立刻處理或者必須液氮保存的不方便。浸入RNAfixer 后,新鮮組織細胞中RNA 可以完好的在37℃下保存一天,在25℃下保存一周,4℃下保存一個月,在-20℃或-80℃下長期保存。
RNA 病毒樣品(如HCV 和HIV)可在37℃保存一個月。適用于動物組織(心、肝、腎、肌肉、睪丸、腦、脾等)、培養細胞、RNA 病毒、 果蠅、細菌、白細胞、一些植物組織等。
產品特點:
1.操作容易:將組織成適當大小,浸沒在RNAfixer 中即可使其RNA 不被降解。
2.無需液氮:使樣品的保存不需液氮,干冰或-80℃冰箱,尤其適用于臨床和野外樣品的快速和大規模采集。
3.方便運輸:處理過的樣品能在25℃保存一周,使樣品郵寄和運輸變得容易和便宜,有利學術合作和交流。
4.多次凍融: 經RNAfixer 處理的樣品可反復凍融多次, 其間可對樣品進行各種處理而不影響最終提取的RNA 的質量。
5.可比性強: RNAfixer 能減少大規模樣品處理中的誤差,增加各次實驗數間的可比性, 對大規?;虮磉_譜的分析尤其有用。
使用說明:
RNAfixer 只用于新鮮組織,浸泡入 RNAfixer 前禁止冷凍組織。只需要迅速將新鮮組織成長、寬,高任意一邊厚度<0.5 厘米浸泡入 RNAfixer 即可(只要有一邊厚度不超過 0.5 厘米,RNAfixer 可以迅速滲透,其它兩邊的尺寸并不重要)。將新鮮組織浸泡 在 5 倍體積的 RNAfixer 中,按照指示存放在適當的溫度。
1.動物組織 RNAfixer 并不破壞或者溶解組織結構,因此浸泡在 RNAfixer 中達到滲透平衡的組織 可以從 RNAfixer 中取出,然后切成更小的塊,然后放回到 RNAfixer 中下次繼續使用。小器官如小鼠肝、腎、脾不需要剪切,可以完整的存放在 RNAfixer 中。
推薦不同組織樣品的 RNAstore 使用量:
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 2.植物組織很多植物組織直接浸泡入 RNAfixer 即可,有的植物有天然滲透屏障如臘質保護層,需要先破壞掉臘質層,便于 RNAfixer 滲透。
3.組織培養細胞細胞吹打下來后,離心收集細胞,棄上清,用冰浴的 PBS 緩沖液洗一次去除殘留培養液。將細胞懸浮在少量 PBS 緩沖液中。加入五到十倍體積 RNAfixer, 混均。
4.白細胞對于全血中白細胞的保存,需將白細胞從紅細胞和血清中分離出來,并按組織培養細胞一樣處理后,白細胞便能有效地保存在 RNAfixer 中。不要將全血、血漿或血清中的 RNA 保存在 RNAfixer 中,因為它們蛋白含量過高,與 RNAfixer 混合后易形成不溶的沉淀。
5.細菌
細菌并不能在 RNAfixer 中生長,但是 RNAfixer 并不破壞細菌,E. coli 在 4℃保存一個月仍舊可以提出完整的 RNA。
RNAfixer 中樣本的存放:
1.存放在-80℃樣品長期保存用。將 RNA fixer 中樣本放置于 4℃過夜,然后將樣本撈出,盡量去除干凈 RNAfixer 液體,然后放置于-80℃。對于組織培養細胞,則不需要去除RNAfixer,直接冷凍于-80℃,并不會裂解細胞。樣品使用時可以在室溫融化,并且還可以再次冷凍而不影響 RNA 的完整性和產量。
2.存放在-20℃將 RNAfixer 中樣本放置于 4℃過夜,然后轉移到-20℃。在-20℃樣品并不會被冰凍,但是可能會形成一些結晶,這并不會影響將來的 RNA 提取。樣品使用時可以在室溫 融化,并且還可以再次冷凍而不影響 RNA 的完整性和產量。
3.存放在 4℃樣本可以在 4℃存放一個月。
4.存放于 25℃存放于 25℃樣本的 RNA 在一周內保持完整,保存兩周的樣品 RNA 有輕微降解,勉強能用于northern analysis, 但是質量足夠用于nuclease protection assay or RT-PCR 。
5.存放于 37℃存放于 37℃樣本的 RNA 在 24 小時內保持完整,3 天的時候有部分降解。RNAfixer 保存樣本的 RNA 提?。?/span>將樣本從 RNAfixer 中取出,RNAfixer 可以直接倒入水池,用自來水沖即可,不需特殊處理。
1.組織
用干凈鑷子將樣本從 RNAfixer 中撈出,用吸水紙稍稍吸去殘留的 RNAfixer 后,可以和新鮮組織一樣按照液氮研磨,然后勻漿處理的標準程序進行提取 RNA。
2.細胞
對于儲存在 RNAfixer 中的細胞有兩種選擇。一是去除 RNAfixer 后提取 RNA, 另一個是直接從細胞和 RNAfixer 的混合物提取。
1)去除 RNAfixer 后提取 RNA存放于 RNAfixer 中的細胞變得不那么脆弱,可以承受較高的離心速度而不被裂解。 我們有在 5000g 離心成功收集細胞的經驗,由于每種細胞的強度不一樣,可以先用不重要的細胞做個預試驗,以保證在使用的速度下離心不會破壞細胞。另一個選擇是在離心前加等體積的 PBS 稀釋 RNAfixer 和細胞的混合物,以減少溶液的密度,使細胞溶液可以沉淀下來。
2)不去除 RNAfixer,直接提取 RNA
也可以直接加 10 倍體積的一步法提取試劑(如 TRIpure,TRI reagent)到細胞和RNAfixer 的混合物,然后按照正常步驟操作。

QQ截圖20240110094643.jpg
PCR基本步驟及注意事項?

一、實驗原理

PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法,它類似于生物體內DNA的復制。在生物體內DNA復制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而體外PCR反應同樣需要類似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設計的特定序列,實現對特定位置的擴增;PCR Buffer提供一個反應的緩沖環境;反應過程同生物體內一樣,DNA雙鏈打開,引物結合模板,延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內靠DNA解旋酶解鏈,而在體外在通過控制反應溫度實現的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈,在退火溫度處引物結合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反復重復此過程即可實現對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環開始才產生出和靶DNA區段相同的DNA分子,進一步循環地產生出靶DNA區段的指數加倍。

在擴增后期,由于產物積累,使原來呈指數擴增的反應變成平坦的曲線,產物不再隨循環數而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續大量擴增,達到較高水平。因此,應適當調節循環次數,在平臺期前結束反應, 減少非特異性產物。到達平臺期(Plateau)所需循環次數取決于樣品中模板的拷貝。

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二、主要的成分

1.模板可以是多種形式,主要包括基因組DNA、質粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產物,cDNA等,但不能為RNA。對于不同類型的模板,其主要不同在于預變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠,質粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產物預變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA,但仍可做PCR的模板,只不過在第一輪循環時只有一個引物結合,合成另一條鏈。從第二輪開始,兩個引物均與特異位點結合,從而實現了與常規PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增,原因就在于實現PCR反應的是DNA聚合酶,只能特意識別DNA鏈。

2.對于模版的量來說,一般25ul體系DNA的質量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結構比較復雜,提取的濃度也往往比較大,為防止濃度過大對PCR造成影響,故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質粒及PCR產物由于其結構簡單,且提取濃度一般較低,則無需稀釋。

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PCR實驗中應該注意的問題有哪些?

沒有ct

檢測結果遇到沒有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1、循環數不夠(一般不超過45循環,不僅背景值提高,定量也不準);

2、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解??赏ㄟ^PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發生模板降解,應考慮樣本準備中雜質的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環, 否則定量不準確。

因此,判斷Ct值出現過晚是否屬于非正常情況, 需要根據具體實驗設計和目的進行。

1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;

2、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產物太長。PCR產物設計超過500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或將模板進行稀釋。



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